作者：德泉兴业
最近一段时间，随着疾病诊疗的精准化，各个版本新冠诊疗指南的出炉，淋巴细胞亚群、精细亚群和细胞因子等与免疫力监控高度相关的指标受到了高度关注。
在众多的免疫指标中，选择哪些监测指标，如何建立自建方案并验证，如何建立与疾病诊疗相关指标的Cutoff值，这些都是当下流式工作者们开展更多免疫指标时会遇到的一些难题。下面这篇文章对上面提到的几个问题做了详细的解答。
【资料图】
01.背景介绍
免疫检查点抑制剂治疗，特别是联合PD-1/CTLA-4阻断，显著提高了转移性黑色素瘤患者的治疗率和总生存率。但同时，与免疫相关的不良反应，如肝炎和结肠炎，是免疫抑制剂治疗过程中常见的并发症，其严重的时候可以危及到生命。在接受PD-1和CTLA-4的一些晚期黑色素瘤患者中，巨细胞病毒(CMV)引起的特异性记忆T细胞反应会导致肝损伤，而有研究表明治疗前血液中CD4+效应记忆T细胞(TEM)的扩增能够可靠地预测肝炎；所以如果有一种方案可以监测效应记忆T细胞，从而预测不良反应的发生，其将具有很好的临床意义。
本文章作者开发并验证了一个10色流式细胞方案，用于可靠地量化外周血样本中的CD4+TEM细胞和其他irAE风险的生物标志物。与以前的方案相比，文章作者的新方案在测量CD4+TEM细胞方面表现出色，并且在从CD4+CD197+CD45RA+幼稚T细胞（NaïveT）分辨CD4+CD197+CD45RA-中央记忆T细胞(TCM)方面表现出色。它还能够精确量化CD14+单核细胞。
02.实验方案
CD4+TEM细胞的标记为CD45+CD3+CD4+CD8-CD45RA-CD197-。单核细胞的相同标记为CD45+CD14+，同时加上将CD16，以对经典、中间和非经典单核细胞进行更精细的分类。有研究表明将CD8+T细胞中的CD279(PD-1)表达确定为黑色素瘤患者接受PD-1/CTLA-4治疗后临床反应的标志物，因此加上CD45+CD3+CD4-CD8+CD279+。为了提高细胞类型定义的准确性，方案中还包括了一个谱系排除(Lin)通道（CD19、CD20、CD56和CD66b）来排除B细胞、NK细胞和粒细胞。因此，新panel包括10个参数：CD45、Lin、CD3、CD4、CD8、CD45RA、CD197(CCR7)、CD279(PD-1)、CD14和CD16，作者将该方案命名为“monocyteandTcell”，简称“MoT”。
该方案用BeckmanCoulter的液体试剂进行验证，并在验证完成后，作者将该方案定制成干粉形式，由于干粉产品相比较液体试剂，不仅可室温保存，并且保存时间更久，同时还可以减少实验操作，样本间一致性也更高等优点，便于日常诊断工作并最大限度地减少差异。
贝克曼库尔特公司不仅可以提供Duraclone干粉成品试剂，还可以提供客户定制CDS，可以根据客户需求，个性化组合定制干粉方案。相比较液体方案来说，定制化的干粉组合方案，不仅有液体单抗方案的自由组合的优点，而且还有干粉试剂的优点。
03.方案圈门策略
该方案用贝克曼库尔特公司的Navios3激光10色仪器进行数据的采集，并使用Kaluza软件进行分析。
3.1对CD45+白细胞进行圈门；
3.2对CD3+T细胞和CD3-细胞进行圈门；
3.3对CD3-内的谱系阴性(Lin-)细胞进行圈门；对CD14+单核细胞进行圈门；对由CD14和CD16表达定义的单核细胞亚群进行圈门；
3.4对CD3+T细胞内的CD4+和CD8+T细胞进行圈门；对CD4+记忆T细胞亚群进行圈门；圈门CD279+CD8+T细胞。
04.检测性能验证
文章作者将此方案与贝克曼库尔特公司的DURACloneIMT细胞亚群管和DURACloneIMBasic管平行分析了来自83名患有II、III或IV期疾病的黑色素瘤患者的样本，其中II期(n=52)、III期(n=11)或IV期(n=20)。除CD14+单核细胞外，其他参数均观察到方法之间的强相关性，CD14+单核细胞显示出中等相关性。
DURACloneIMBasic和DURACloneIMT是贝克曼库尔特公司的DuracloneIM全套抗体组合方案中的第1管与第3管。该产品的优点是干粉，保存的时间比液体更久；而且预混抗体也能节省实验时间，相比于自己混匀抗体后分装染色，样本间的一致性会更高。产品质量满足ISO9001认证标准（ISO9001-2008）。
文章作者之前确立了一个cutoff值≥16%CD4+TEM细胞作为CMVIg+患者检查点阻断相关肝炎的预测因子。因此在将患者分类为CD4+TEM≥16%或CD4+TEM<16%时，DURACloneIMT细胞亚群管和MoT测试管结果在81/83例(98%)中一致。此外，E图显示在确定CMV血清学状态，并在治疗开始后12周内评估免疫相关肝炎的发展。红色虚线表示CD4+TEM≥16%的cutoff值，中值用黑线表示，MoT方案在预测16名IV期黑色素瘤患者的肝炎方面表现良好。F图显示6名CMVIgG+CD4+TEM≥16%黑色素瘤患者中有5名正确预测了肝炎。
经过验证，文章作者用cutoff值≥16%CD4+TEM细胞作为CMVIg+患者检查点阻断相关肝炎的预测因子，相关的PPV=83%，NPV=80%。
另外，文章作者还从批内精密度、批间精密度、操作者间分析精度、样本稳定性、样本染色稳定性、年龄、性别和疾病相关偏倚、季节性等方面进行了验证，确保该方案结果是在可接受范围内的，由于篇幅的关系，就不一一列出来了，感兴趣的读者可以去原文查看，其详细的介绍了作者验证思路与结果。
文章来源：
Hannah-LouSchilling,GuntherGlehr,MichaelKapinsky,etal.DevelopmentofaFlowCytometryAssaytoPredictImmuneCheckpointBlockade-RelatedComplications,FrontiersinImmunology,(2021)12:doi:10.3389/fimmu.2021.765644
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